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細菌蛋白提取與純化的實驗手冊
  • 發布日期:2016-07-27     信息來源:      瀏覽次數:3436
    • 不同的蛋白質分離純化的方法不同,但蛋白質分離純化的操作步驟基本類似,那么如何進行細菌蛋白的提取呢?這里總結細菌蛋白的提取的實驗試劑、操作步驟以及一些注意事項。
      實驗試劑
      采用T7• Tag Affinity Purification Kit
      T7•Tag抗體瓊脂。B/W緩沖液:4.29mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl, 0.137mM NaCl,1%吐溫-20,pH7.3 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸,pH2.2. 中和緩沖液:2M Tris,pH10.4。 PEG 20000。

      實驗步驟
      1.100ml 含重組表達質粒的菌體誘導后,離心5000g×5min,棄上清,收獲菌體,用10ml預冷的B/W緩沖液重懸。
      2. 重懸液于冰上超聲處理,直至樣品不再粘稠,4℃離心 14000g×30min,取上清液,0.45μm膜抽濾后作為樣品液。
      3. 將結合T7•Tag抗體的瓊脂充分懸起,平衡至室溫,裝入層析柱中。
      4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。
      5. 10ml B/W緩沖液過柱,洗去未結合蛋白。
      6. 用5ml洗脫緩沖液過柱,每次1ml,洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集,混勻后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。
      7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中,雙蒸水透析24hr,中間換液數次。
      8. 用PEG 20000濃縮蛋白。
      注意事項
      蛋白在過層析柱前,要0.45μm膜抽濾,否則幾次純化后,柱子中會有不溶物。

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